극한미생물을 이용한 최대의 연구는 바로 PCR입니다. 개발자인 캐리 멀리스 (Kary B. Mullis)가 노벨상까지 탓죠. 그가 노벨상을 받은 1993년이 제가 처음 PCR을 직접 해본 그 해 입니다. 당시 학과에 한 대 밖에 없는 PCR 기계의 사용법을 배우고 혹시라도 극미량의 DNA가 오염될까봐 손에 비닐 장갑을 끼고 난리를 치던 생각이 나는군요. 멀리스는 Thermus라는 고온성 세균을 이용했지만 최근에는 Pyrococcus나 Thermococcus류의 Thermococcales의 DNA polymerase를 많이 이용합니다. DNA 증폭시 에러의 확률이 훨씬 낮기 때문이죠.

그런데 오늘 네이처지에서 오는 스팸메일의 제목이 바로 이 포스트의 제목과 같았습니다.

"Extremely fast and accurate DNA polymerase from Finnzymes"

저 Finnzymes라는 회사는 핀란드의 바이오텍 회사인데 주로 제한효소나 연구용 효소를 다루는 회사입니다. 몇년전에 네이처에서 핀란드의 바이오텍 산업에 대해 다룰 때 나왔던 회사죠.

Boosting biotech in Finland (Nature, 2004, 431, 1020-1021)

핀자임스의 PCR 기술을 Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase이라고 명명한 모양입니다. 저는 회사의 광고를 그대로 믿는 사람이 아닙니다만 자기네들이 주장하는 fidelity가 Taq Pol의 52배라고 하네요.

사용자 삽입 이미지

위 그림만 가지고 본다면 아마 최고의 fidelity를 자랑하는 모양입니다. 에러확률이 4.4 x 10-7라고 하네요. Taq Pol은 fidelity가 낮아서 Site-directed mutagenesis 등에 사용하지 못하죠. 보통 pET based 발현 벡터의 크기가 5 - 10kb (10의 4승)미만이니까 Site-directed mutagenesis에는 좋겠습니다. 나머지 polymerase들은 전부 거의 비슷비슷한 초고온성 아키아 (Hyperthermophilic Archaea)에서 나오는 효소이거나 분자진화를 이용해 fidelity를 높인 것입니다.

 

Figure 2. Error rates of different DNA polymerases. Fidelity assays were done using lacI-based method modified from Frey & Suppmann, 1995.


게다가 빠르군요. 보통 Taq Pol의 경우 1kb에 1분을 많이 사용하지만 Pfu는 사실 그것보다 느려서 증폭에 시간이 꽤 걸립니다. 그래서 벡터를 통째로 PCR해야하는 Site-directed mutagenesis의 경우엔 반나절 이상 시간이 걸리는 경우가 많죠. 이 경우는 거의 1분에 1kb 정도의 속도가 나는 것 같습니다. (물론 다시 말하지만 회사의 데이터를 전부 그대로 믿으면 안됩니다...^^)

Extreme speed and yield
The fusion of a double-strand DNA-binding domain to Phusion DNA Polymerase multiplies its processivity in respect of other DNA polymerases. This dramatic increase in processivity results in shorter extension times, more robust and high yield amplification, and the ability to do long templates in a fraction of the time. A 3.8 kb human genomic DNA fragment was amplified with various polymerases using extension times ranging from 1 min to 7 min 40 sec (see figure 3 below). Phusion DNA Polymerase gave strong specific bands even with the shortest extension time, completing the 3.8 kb fragment with only a one minute combined annealing and extension step. Enzyme amounts also indicate that significantly less of the highly processive Phusion DNA Polymerase is required to complete the task.

 

Figure 3. A 3.8 kb human beta globin gene was amplified according to supplier’s
recommendations using varying extension times.


Cycling protocols and enzyme amounts:


Pyrococcus
furiosus

modified
P.furiosus

Phusion DNA Polymerase

Enzyme amount

5 U / 50 µl

2.5 U / 50 µl

1 U / 50 µl

Initial denaturation

95 °C 45 s

95 °C 2 min

98 °C 30 s

Denaturation

95 °C 45 s

95 °C 30 s

98 °C 10 s

Annealing

60 °C 45 s

60 °C 30 s

-

Extension a,b,c and d*

72 °C x min

72 °C x min

72 °C x min

Cycle number

30

30

30

       

*Extension times: a) 1 min, b) 1 min 30 s, c) 3 min 50 s and d) 7 min 40 s.

아무튼 한 번 사용해 보고 싶군요. 네이처에서 단순히 광고한 것인지 아니면 정말 성능이 뛰어난 것인지 확인해보게 말입니다.
Posted by 바이오매니아


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